国外

由Rachon,D Vortherms,T; Seidlova-Wuttke,D; Menche,A; Wuttke,W关键词:UTERUS,MENOPAUSE,PHYTOESTROGENS,EQUOL,增殖细胞核抗原,胰岛素样生长因子I,孕酮受体,补体蛋白3摘要目的本研究的目的是评价给药的子宫内膜作用

在绝经的卵巢切除大鼠模型中,膳食雌马酚,大豆来源的大豆苷元或红霉素中存在的芒柄花素的代谢产物方法使用两剂外消旋雌马酚(50 mg / kg食物和400 mg / kg食物),结果将两剂雌二醇-3苯甲酸酯(E2B)(43 mg / kg食物和173 mg / kg食物)进行比较3个月后,处死动物,取出子宫,称重并石蜡包埋,进行形态计量学和免疫组化评估选择的子宫雌激素反应基因的表达也使用实时逆转录 - 聚合酶链反应测量结果与对照组相比,用高剂量牛尿酚治疗的动物的子宫重量我们显着更高,呈现轻度雌激素刺激的组织学特征,并且具有更大的上皮高度和子宫基质和子宫肌层的厚度

对于增殖细胞核抗原(PCNA)的存在的染色也显示出更大的PCNA阳性细胞的流行

大剂量雌马酚处理动物的子宫基质相反,子宫上皮细胞PCNA阳性细胞百分比低于对照组饮食大剂量牛尿酚处理也显着增加子宫胰岛素样生长因子1,黄体酮受体水平和补体蛋白3 mRNA虽然具有统计学意义,但与低剂量和高剂量E2B治疗的效果相比,所有这些影响的数量都较低

低剂量雌马酚对上述研究参数没有任何影响

术语大剂量膳食雌马酚给予卵巢切除大鼠在细胞和分子上发挥子宫收缩作用ar级别,质疑子宫完好无损的绝经后妇女不受控制和无限量食用大豆或红三叶草补充剂的安全性简介大豆(Glycine max)和红三叶草(Trifolium pratense)提取物现在被广泛宣传为更有效的治疗更年期症状雌激素使用引起的不良副作用[1]然而,最近几项关于这些制剂改善绝经后妇女雌激素缺乏症状的有效性的临床试验的结果却不一致,并质疑它们的安全性.3大多数不确定性与潜力有关这些制剂对雌激素敏感组织的不良影响子宫是主要的雌激素靶点之一,绝经后妇女的无对抗雌激素治疗会诱发子宫内膜增生和子宫内膜癌的风险

另外,绝经后用雌激素治疗可能会增加子宫平滑肌瘤形成的风险6结果来自研究大豆或红三叶草提取物对人子宫的影响的大量研究在很大程度上尚无定论4'7-9然而,最近,在一项大型随机和安慰剂对照试验中,观察到子宫内膜增生的发生率有少量但显着增加

绝经后妇女每天服用150毫克纯化的异黄酮,为期5年.10雌马酚(7-羟基-3-(4'-羟基苯基)1(-enroman)是胃肠道微生物群落生物转化的终产物

红三叶草中发现的大豆异黄酮大豆苷元或芒柄花素它是一种手性分子,以R和S形式存在,对映体形式11与17β-雌二醇(E2)结构相似,对两种雌激素受体(ERα和ERjS)具有亲和力12-14这一证据有人们担心绝经后不受控制和大剂量摄入大豆和/或三叶草制剂实际上可能对雌激素敏感组织产生不良影响S-牛尿酚在人类,但30-50%的成年人口没有足够的肠道菌群生产15本研究的目的是评估在绝经的卵巢切除大鼠模型中饮食中雌马酚的给药效果

使用两剂牛尿酚并与啮齿动物食物一起服用3个月,以模仿绝经后妇女长期使用含大豆或红三叶草的补充剂 评估子宫重量,组织学,增殖细胞核抗原(PCNA)存在的染色以及三种雌激素反应基因的表达:胰岛素样生长因子1(IGF-I),孕酮受体( PR)和补体蛋白3(C3)然后将所有获得的结果与雌二醇-3苯甲酸酯(E2B)的作用进行比较材料和方法动物所有实验均在2005年进行,并由地方动物护理伦理委员会批准

根据德国动物福利法规,在德国不伦瑞克地区当局的许可下,在哥廷根的乔治奥古斯丁大学使用(编号50942502 / 01-3603)60只雌性Sprague-Dawley老鼠在动物设施中饲养

使用哥廷根大学诊所动物在12小时光照,12小时黑暗循环,在22-24℃的室温和相对腐殖质下在Makrolon笼(类型4)中以六个一组保持

dity 50-55%,可自由饮水为了消除在常规啮齿动物食物中发现的大豆异黄酮的暴露,他们用无大豆食物(Ssniff Spezialdiaten GmbH,Soest,德国)喂养,3个月(平均值)体重244g),动物在氯胺酮(1875mg /动物,Ketavet,Pharmacia&Upjohn,Erlangen,德国)和赛拉青(225mg /动物,Rompun 2%,Bayer,Leverkusen,德国)麻醉后双侧卵巢切除术后进行卵巢切除术,将动物随机分组,每组6只,分成4个治疗组(每组12只动物)对照组仅接受无大豆食物低剂量和高剂量E2B组接受无大豆食物加入E2B(98%纯度,Sigma-Aldrich Chemie GmbH,St Louis,USA)分别浓度为43mg和173mg / kg食物

低剂量和高剂量雌马酚组通过添加外消旋混合物接受无大豆食物雌马酚(98%纯度,常州大华进出口集团,中国)a分别为50 mg和400 mg / kg饲料

啮齿动物饲料由Ssniff special diets GmbH(德国Soest)提供,通过将测试物质与无大豆配方Ssniff SM R / M(10)混合制备

在造粒过程之前将颗粒制成均匀的动物随意喂养动物,根据食物摄入记录,计算整个实验期间每只动物的测试物质的平均消耗量

高剂量组分别为每只动物每天007毫克和020毫克

低剂量和高剂量组的雌马酚平均消耗量分别为每只动物092毫克和654毫克,分别为3个月后血清和器官采集治疗后,动物在8:00和12:00之间在CO2麻醉下断头

将血液从胴体排出到聚丙烯管(Sarstedt,Nuembrecht,Germany)中并在4℃下保持2-4小时然后获得血清

在4℃的温度下以2500rpm离心样品30分钟后,将样品以四联体等分到15ml聚丙烯管(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)中并在-20℃下储存直至进一步分析腹腔纵向切开,子宫切除子宫角切除无粘附脂肪和肠系膜称重后,将一个子宫角固定在10%缓冲福尔马林中进行组织学评估和免疫组织化学研究将对侧角转移到2毫升聚丙烯管(Sarstedt),在液氮中冷冻,并储存在-70℃以进一步分析子宫组织学和免疫组织化学福尔马林固定的子宫角被石蜡包埋,横向切成5μm厚的切片并用苏木精染色 - 曙红对于形态学分析,已知的E2诱导特征被评估固有层细胞的形状和极性,上皮有丝分裂象记录和坏死,测定腺体和子宫内膜上皮的肥大和增生,以及记录鳞状上皮化生和子宫内膜炎的病理特征

另外,记录内皮细胞的高度(放大250倍)和子宫基质和子宫肌层的厚度(放大50倍) x)使用基于计算机的形态测量系统(Soft Imaging System,Munster,Germany)在每组的10只动物中测量 在中间横向组织切口中随机选择的区域获得10次测量,并计算每只动物的平均值

对于免疫组织化学研究,在抗原修复后使用PCNA的单克隆抗体(PC-10,sc 56,Santa Cruz Biotechnology)

用柠檬酸盐缓冲液中的微波辐射技术用过氧化物酶和DAB进行最后的免疫反应(EnVision TM -DAB,Dako Cytomation,K5007)检查10个代表性的高倍视野(~400)并计算每个田地中的100个细胞PCNA标记指数被确定为具有明确核染色的细胞数除以计数的细胞总数(每1000个),以百分比表示

所有上述组织学评价均对治疗组进行了不知情的血清17β-雌二醇和雌马酚测量使用雌二醇II试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,Mannh)在Roche Elecsys 2010免疫测定分析仪上测量血清E2水平

eim)该测定的最低检测限为184 pmol / l,平均内部和相互变异系数分别为27%和34%

血清雌马酚水平分别通过高压液相色谱(HPLC)和260 nm紫外检测测量

HPLC条件是梯度洗脱,0分钟70%A 30%B,15分钟25%A 75%B(A,含有0085%O-磷酸的水; B,乙腈; 250 x 4 mm C ^ sub 18 ^反相色谱柱,流速1 ml / min)RNA提取和逆转录RNA提取前,在不锈钢存在下,将预冷冻的子宫破碎并在预冷的Teflon容器中在液氮中均质化使用Mikro-Dismembrator(B Braun Biotech International GmbH,Melsungen,Germany)在2500rpm下快速搅拌20秒,在整个过程中,将样品保持在液氮或干冰中然后将组织粉末转移回来

进入聚丙烯管并保持在-70℃

对于RNA分离,使用30mg组织匀浆,并使用RNeasy Total RNA Kit(Qiagen,Hilden,Germany)根据制造商的说明进行提取过程

使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000 LabChip试剂盒(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)检查分离的总RNA的完整性,并用紫外分光光度计测量其浓度

波长为260nm和280nm的仪器(Biophotometer,Eppendorf,Hamburg,Germany)然后,用不含RNase的水稀释每个样品以达到20ng /μl的终浓度

进行逆转录反应总体积为20μl,含有1x反应缓冲液(50mM Tris-HCl,75mM KCl,3mM MgCl 2,2mM,50mM二硫苏糖醇)(Promega,Madison,USA),100ng随机六聚体引物(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),05mM dNTPs(Invitrogen),200U M-MMLV逆转录酶(Promega,Madison,USA),4U RNasin和200ng总RNA(Promega,Madison,USA)样品在22℃温育10分钟以使引物退火;逆转录在42℃下进行50分钟

在孵育结束时,将样品在95℃加热10分钟以使酶失活并使RNA-cDNA杂交体变性

整个反应在三重中进行

Thermoblock(Biometra,Gottingen,Germany)实时聚合酶链反应实时聚合酶链反应基于5'-核酸酶测定16,其在ABI Prism 7700序列检测系统(TaqMan,PE Applied Biosystems,Foster City, CA,USA)先前已经描述了C3,IGF-1和孕酮受体(PR)的引物和探针序列以及使用的浓度

它们全部购自Eurogentec(比利时Seraing)

实时PCR反应在96上进行

-well微量滴定板(MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate,PE Applied Biosystems,Weiterstadt,Germany),25μl体积,含有1×TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Applied Biosystems),适当的引物和杂交探针浓度,和2 [随后,样品在40个循环中扩增

每个循环由在95℃下15秒的变性阶段和在60℃下1分钟的杂交/延伸阶段组成

统计分析所有数据表示为算术平均值±标准差在实时PCR实验中分析mRNA水平的相对变化 将对照组中测量的绝对数据的平均值设定为100%,并且在各个测定中确定的所有其他值均相对于该平均值表示单因素方差分析,然后进行Dunnett事后检验以进行多重比较

比较研究组之间的差异,p值结果对血清17β-雌二醇和牛尿酚浓度的影响正如预期的那样,饲喂低剂量和高剂量E2B-补充饲料的动物与对照组相比具有显着更高的平均血清E2水平(133 + - 分别为17 pmol / l和312±61 pmol / l vs 85 + - 7 pmol / l,p 005)低剂量和高剂量含有雌马酚的食物喂养的动物的平均血清牛尿酚浓度为33±49 nmol /对照组和E2B处理的动物血清中检测不到雌马酚和1095±564 nmol / l对子宫重量的影响如表1所示,低剂量雌马酚处理动物的子宫重量与控件在续用高剂量雌马酚喂养的动物与对照动物相比具有显着更高的子宫重量(p对子宫组织形态的影响用低剂量雌马酚处理的动物的子宫的组织学分析没有显示任何雌激素刺激的特征,它们类似于对照组子宫内膜由子宫腔内衬的低立方上皮组成,子宫基质由无反应的基质细胞组成

相反,在高剂量雌马酚治疗组的12只动物中有6只,子宫内膜上皮由高大组成

柱状细胞表现出增加的有丝分裂活性和基质中的一些分化用低剂量和高剂量饮食E2B处理的动物显示出雌激素刺激的典型特征子宫内膜由具有高有丝分裂活性的高,假复层柱状细胞组成

在高剂量E2B-中治疗组,鳞状化生征也有子宫间质由低分化的E2B剂量处理的动物和用高E2B剂量处理的3只动物组成的子宫内膜的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润的形态学分析显示,与对照组相比,用大剂量膳食雌马酚具有更大的子宫内膜上皮高度(103±13 pm与90 + - 07 pm,p表1 3个月膳食雌马酚和雌二醇-3苯甲酸酯(E2B)治疗对卵巢切除的Sprague体重和子宫重量的影响 - Dawley大鼠数据表示为平均值±标准差

此外,与对照组相比,子宫内PCNA表达存在的免疫组织化学染色显示,高处理动物的子宫基质中PCNA阳性细胞的患病率更高

-dose equol(34±03%vs 24 + - 04%,p对子宫IGF-1,PR和C3基因表达的影响IGF-1,孕酮受体和C3的子宫表达通过ERa-m上调相关的通路可以作为子宫内配体依赖性雌激素受体激活的敏感指标19因此,在我们实验的最后一步中,我们使用定量评估了饮食中雌马酚给药对上述基因子宫表达的影响

实时PCR方法然后将获得的结果与E2B的效果进行比较与对照组相比,高剂量雌马酚处理的动物的子宫IGF-1 mRNA水平显着更高(194±75%vs 100 + - 27%,讨论本研究的目的是研究雌马酚在绝经卵巢切除大鼠模型中的子宫内膜效应

我们的结果清楚地表明,相对较高剂量的长期雌马酚消耗在去卵巢的Sprague-Dawley大鼠中具有明显的子宫内效应

在细胞和分子水平上注意到子宫重量的增加,雌激素刺激的迹象与对照相比,来自喂养的动物的子宫gh-剂量雌马酚表现出雌激素刺激的特征性特征,如子宫内膜上皮高度和子宫基质和子宫肌层厚度的增加虽然有统计学意义,但这些变化的幅度低于E2B给予的低浓度和低浓度

高剂量 PCNA是一种36kDa的核蛋白,在细胞周期的S期表达增殖细胞,其存在的免疫染色已被证明在评估细胞增殖方面具有实用价值20,也是癌症预后研究的有用工具21,22 PCNA免疫染色方法也显示与其他细胞增殖指标相关,如胸腺嘧啶标记指数和流式细胞仪测定的S期分数23,24因此,在我们的研究中,我们还评估了PCNA阳性细胞的数量

子宫内膜上皮细胞和子宫基质子宫内膜的基质和上皮细胞在雌激素暴露期间迅速增殖,雌激素撤除导致其凋亡25,26因此,我们的结果,大剂量雌马酚或E2B治疗增加PCNA阳性的数量基质中的细胞并不令人惊讶相比之下,发现用高剂量牛尿酚和低剂量或高剂量长期饮食治疗se E2B降低子宫内膜上皮细胞中PCNA阳性细胞的百分比是相当出乎意料的

在完整的,正常循环的大鼠中,当雌激素水平高时,腔内上皮中PCNA的表达从发情期到发情前期增加但是,在发情期间,当雌激素时随着短期(2周)皮下雌激素治疗增加卵巢切除大鼠腔和腺上皮中PCNA的表达[27]

在我们的实验中,尽管大剂量雌马酚,但是已经显示短期(2周)皮下雌激素治疗增加PCNA在去卵巢大鼠的腔和腺上皮细胞中的表达

与对照动物相比,低剂量或高剂量E2B处理增加了腔上皮的高度,PCNA的表达降低

对这一矛盾发现的解释可能是长期雌激素暴露导致PCNA的下调

在子宫内膜上皮细胞中的表达在对Diel及其同事的一项研究中28,已经证明了子宫内膜上皮细胞口服大豆苷元给药后7小时内PCNA mRNA水平升高但24小时后已降至卵巢切除对照水平但是这一假设值得进一步研究图2卵巢切除大鼠子宫基质和上皮细胞PCNA阳性细胞的患病率膳食牛尿酚和雌二醇-3苯甲酸酯(E2B)治疗3个月(a)与对照组相比,用高剂量饮食牛尿酚治疗的动物在子宫基质中的PCNA阳性细胞百分比更高这种效果在治疗的动物中也很明显

低剂量和高剂量E2B(b)相反,高剂量牛尿酚以及低剂量和高剂量E2B治疗降低了子宫上皮细胞中PCNA阳性细胞的百分比* p雌激素的子宫内膜效应是由于子宫IGF-1表达的激活反过来刺激子宫组织(子宫肌层和子宫内膜)的增殖29'30此外,子宫暴露于雌激素剧增加PR和C319,31的子宫表达,这些作用主要由ERalpha32介导,并且被认为是比子宫重量增加更多的雌激素敏感参数19,33因此,在我们的实验中,我们还测量了IGF-1的子宫mRNA水平

,PR和C3大剂量牛尿酚治疗显着增加所有三种上述基因的子宫表达尽管有统计学意义,但IGF-1,PR和所有这些效应均低2倍,3倍和60倍以上

C3基因的表达分别与E2B的作用相比据我们所知,这是关于饮食雌马酚对卵巢切除大鼠子宫IGF-1,PR和C3基因表达影响的首次报道尽管如此,大豆衍生的雌马酚前体大豆苷元已经显示在大鼠子宫19和大鼠子宫内膜腺癌细胞系中显着上调子宫C3的表达.34也显示子宫内膜PR基因表达在卵子中上调切除食用的食蟹猴饲喂大豆异黄酮(染料木黄酮和大豆苷元)28-33天然而,在暴露于雌激素或雌激素激动剂期间,ERalpha介导的子宫C3基因表达增加的作用尚不清楚.C3是参与其中的关键蛋白

补体激活级联,是细菌感染先天免疫的重要组成部分 因此,我们可能只推测其在雌激素暴露期间的表达增加,例如在发情前期或在怀孕期间,可以保护子宫和泌尿生殖道免受细菌感染,从而提高受孕和怀孕的机会

此外,ERalpha介导的 - 在雌激素暴露期间调节子宫PR表达可使子宫内膜对孕酮作用更敏感,从而促进受精卵的植入和成功妊娠36 IGF-1反过来在介导子宫内雌激素的促有丝分裂作用中发挥作用30然而,体外研究显示IGF-1还可以刺激子宫内膜癌细胞37的增殖以及促进平滑肌瘤细胞生长[38],这解释了长期雌激素暴露与这些妇科疾病在老年妇女中的患病率53'39因此,子宫IGF-1表达可能是af影响子宫生理学和病理学的几个不同方面图3膳食雌马酚和雌二醇-3苯甲酸酯(E2)对子宫IGF-1,孕酮受体(PR)和C3基因表达的影响,(a)高剂量治疗的动物与对照相比,膳食雌马酚具有显着更高的子宫IGF-1 mRNA水平

另外,用高剂量饮食牛尿酚治疗显着增加子宫PR mRNA(b)以及C3水平(c)然而,这些影响的量级与低剂量和高剂量E2B治疗的效果* p在我们的实验中,另一个发现是用低剂量和高剂量E2B治疗的动物体重明显低于对照组

然而,这并不奇怪,因为来自我们之前的实验和其他人的研究结果清楚地表明,雌激素治疗减弱了大鼠卵巢切除引起的体重[18,40]

然而,这种效应对于检测的其他参数没有任何混淆效应

他的研究据我们所知,这是关于饮食雌马酚给药去卵巢的Sprague-Dawley大鼠的子宫内效应的第一份报告然而,在Selvaraj及其同事的一项优雅研究中,每天皮下注射雌马酚给卵巢切除的C57BL / 6小鼠12天通过Ki-67标记指数测量的子宫重量增加和上皮细胞增殖口服牛尿酚给药诱导了类似的趋势,但是在子宫体重增加的情况下,它们没有达到统计学意义41肠道雌马酚给药也被证明是绵羊中的uterotropic 42和未成熟的大鼠43相比之下,伍德及其同事没有观察到饮食雌马酚给予切除卵巢的食蟹猴的任何显着的子宫内效应

然而,作者指出,与啮齿动物相比,人类和猴子产生显着水平的肾上腺雄激素,可转化为雌酮和雌激素背景,进一步增加17β-雌二醇),使他们的雌激素靶组织对雌马酚的雌激素作用不太敏感35鉴于其与人体生理学的相关性,我们的实验中使用的雌马酚的剂量也值得讨论,而传统的基于大豆的亚洲饮食每天提供约16毫克大豆苷元44,用于缓解绝经后妇女“热潮红”的市售和“非处方”大豆制剂通常含有50毫克至70毫克/片剂45-47轶事证据还指出,有些妇女的剂量高达150毫克每天纯净的大豆苷元,相当于平均每公斤体重25毫克虽然无法预测雌马酚生产者的肠道菌群中有多少可转化为纯雌马酚,药理学家声称任何测试的剂量施用于大鼠的物质必须比人类高10-15倍才能发挥等效作用48'49此外,为了平衡外消旋mi的事实使用牛尿酚而不是其S形式,其被认为是更活跃的异构体50,剂量应加倍根据平均食物摄入量的计算,“高剂量”组中雌马酚的日平均消耗量为217 mgJkg体重因此,本研究中使用的剂量可能对绝经后妇女的健康很重要 总之,对卵巢切除大鼠长期大剂量饮食牛尿酚给予细胞和分子水平的子宫内膜效应;该结果质疑绝经后子宫完好无损且无限制地消费大豆或红三叶草补品的安全性利益冲突无资金来源这项工作由欧盟委员会拨款资助:EURISKED(合同号EVKl-CT2002-00 128)和CASCADE(合同号FOOD-CT-2004-506319)参考文献1 Mahady GB,Parrot J,Lee C,Yun GS,Dan A植物性膳食补充剂在绝经期和绝经后妇女中的应用更年期2003; 10:65-72 2 Wuttke W ,Jarry H,Westphalen S,Christoffel V,Seidlova-Wuttke D植物雌激素用于激素替代疗法

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